【貨號】 BC-C-MI-016

【規格】 1* 106 個/T25 培養瓶（或凍存管）

【保存】 液氮保存，長期

【產品介紹】

 

【操作步驟】

【細胞復蘇】

1 、取出 1mL凍存管后，迅速放入 37℃水浴鍋中不斷搖晃使其解凍，直至凍存管中無結 晶（此過程盡量在 2min內完成）；

2 、準備 15mL離心管，加入 2-6mL完培，將凍存管中的細胞懸液移至離心管，1000 rpm 離心 3~5min；（比較難養的細胞可適量增加離心管中的完培）

3 、吸棄上清，用新鮮培養基重懸細胞，接種至無菌的培養器皿中，輕晃動混勻后放入 37℃ 、5%CO2 細胞培養箱中培養.

注：復蘇第二天若細胞狀態較好，但漂浮碎片較多可做換液處理；

復蘇的細胞需要時間恢復狀態，當復蘇好后密度低于 80%時，2 天內暫時不要換液，細 胞生長狀態恢復后再進行后續傳代等操作；

【細胞傳代】

當細胞匯合度達到 80%-90% ，即可傳代培養。

收集細胞：貼壁細胞可以參考以下方法 1 、吸去培養液，加入不含鈣鎂的PBS ，輕輕潤 洗瓶底 1-2 次，吸棄PBS；2、加入 0.25%胰酶-EDTA消化液（T25 瓶 1-2mL，T75 瓶 2-3mL）， 鋪勻瓶底放入培養箱中消化 1-2min；（部分細胞貼壁較牢，可采用分步消化：將消化下來  的細胞轉移至離心管終止，在培養瓶中加入胰酶繼續消化，直至大部分細胞脫落）3 、倒置 顯微鏡下觀察大部分細胞變圓脫落，迅速加入完全培養基終止消化，完培與胰酶比例為 2:1； 4 、輕輕吹打細胞后吸出轉移至離心管中。半貼壁半懸浮細胞需先收集懸液至離心管再參考 貼壁細胞操作。

離心：收集好的細胞在 1000rpm條件下離心 3~5min ，離心好后棄除上清液。

接種：準備好新的培養瓶并添加適量完全培養基，在離心管加入 1-2mL完全培養基重懸 吹打均勻，初次傳代將細胞懸液按 1:2 比例接種到新的培養瓶中，后續可根據細胞實際情況 按 1:2- 1:4 的比例傳代；接種完成后放入 37℃ 、5%CO2 細胞培養箱中培養。

懸浮細胞建議采用半換液傳代：將培養瓶站立靜置 5- 10min ，肉眼可見細胞沉底，吸取 1/2~2/3 上清至離心管離心，將瓶內剩余懸液按 1:2 或 1:3 的比例轉移至新的培養瓶，將離心 管中的細胞重懸后放入培養瓶添加新鮮完全培養基即可。

【細胞凍存】

收集細胞參考細胞傳代步驟。

凍存液重懸：細胞按照傳代步驟收集細胞至離心管并計數，根據計數的密度決定細胞凍 存數量，一般推薦細胞凍存密度為 1×106- 1×107 個活細胞/管。離心后棄上清，加入配制好 的凍存液重懸，分配到凍存管中，每管 1mL。

凍存：將凍存管放入程序降溫盒中進行梯度降溫，然后放入-80℃冰箱降溫，24h后將凍 存管轉入液氮罐中。若沒有凍存盒，可于冰箱 4℃放置 30min ，隨后轉移至-20℃冷凍 2h，

接下來將其放于-80℃超低溫冰箱中過夜，最終放置于液氮中以長期保存。

【注意事項】

（1）所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全柜內操作，并注 意防護。所有廢液及接觸過此細胞的器皿需滅菌后方能丟棄。

（2）若細胞在操作過程中發生污染，需對污染的細胞進行滅活方可丟棄。

（3）本庫的細胞系（株）僅用于科研工作，未經許可不得用于其他目的，使用者不得 將本庫細胞系（株）轉讓給第三者。

（4）細胞到貨后建議在前 3 代時凍存一批細胞種子以備后續用。