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森貝伽生物：開學啦，這些細胞常見問題你遇到了嗎？

一、細胞復蘇時出現狀態異常的原因及解決方式？

① 污染：

培養器皿可能受到細菌、真菌或其他微生物的污染，導致細胞狀態不佳。所以我們需要確保在細胞培養過程中，耗材及操作等都必須嚴格按照無菌要求，避免任何可能的污染源。

② 營養不足：

培養基中的營養物質不足或不平衡，無法滿足細胞的需求。這時候需要根據細胞類型的需求，調整培養基成分，確保提供適當的營養物質和生長因子，保證細胞的正常生長。

③ pH值異常：

培養基的 pH 值偏高或偏低，超過了細胞所能耐受的范圍。一般動物細胞大多數需要輕微的堿性條件，其pH維持在7.4時細胞生長最好。

④ 氧氣和二氧化碳濃度：

培養環境中的氧氣和二氧化碳濃度不合適，會直接影響細胞的呼吸和代謝。在細胞培養過程中需要提供一定量的氣體（氧氣和二氧化碳）。CO2具有調節pH和緩沖的作用，一般提供5% CO2。

⑤ 細胞密度過高：

細胞在培養皿中過于密集，導致缺乏足夠的營養和空間。在培養過程中需要根據細胞類型和培養皿的大小，調整細胞的種植密度，確保細胞能夠獲得足夠的營養和生長空間。

⑥ 細胞凍存方式不當：

細胞在凍存時不恰當導致細胞在-80℃冰箱或者是在液氮當中死亡，從而導致細胞無法復蘇。在凍存細胞前要進行細胞計數，合理使用程序降溫盒進行梯度降溫。


二、細胞培養中不貼壁了怎么辦？

① 消化過度：

在消化過程中縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度，鏡下觀察細胞剝離的狀態，及時終止消化。

② 支原體污染：  

取培養24小時的培養基，檢測支原體。清潔培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物。

③ 培養基pH值過堿（NaHCO3分解）：

可以使用無菌醋酸溶液調整pH值或充入無菌CO2來調整培養液的PH值。

④ 細胞老化：

建議復蘇新的保種細胞，一般細胞老化的細胞會持續出現較嚴重的形態變化或者凋亡的情況。

⑥ 接種細胞起始濃度太低或太高 。

建議調節最佳接種細胞濃度。當細胞濃度太高則貼壁位置不夠，細胞濃度太低則勢單力薄，培養基的輕微晃動就可能使其脫落。


三、關于培養基的常見問題

① 為什么培養基顏色會有不同深淺：

不同品類的培養基中的酚紅指示劑添加含量也是不相同的，所以客戶會看到不同種類的培養基會有不同顏色；一般顏色的深淺為DMEM＞MEM＞DMEM/F12＞RPMI1640＞F12。

② 培養基在冰箱中為什么顏色會變深：

因為在空氣中CO2濃度低，而培養基內CO2則會逐漸溢出，HCO3-減少，就會造成培養基偏堿，液體顏色變深。

③ 培養基中含有谷氨酰胺的保存條件：

谷氨酰胺對溫度比較敏感，溫度越高的話降解速度越快。并且谷氨酰胺在溶液中不穩定，一般應置于-20℃冰箱中保存。加有谷氨酰胺的液體培養基應存放在2℃–8℃溫度中保存。

④ DPBS和PBS有什么區別：

這兩者都屬于磷酸鹽緩沖液，成分上只有一點點磷酸鹽的含量差異，均有等滲和調節pH的功能，大多數對于細胞的使用上可以通用。

⑤ HBSS和PBS/DPBS有什么區別：

HBSS緩沖液中鹽成分較PBS和DPBS更復雜，且含有葡萄糖，可為細胞提供簡單的營養，而PBS/DPBS不能提供營養。